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免疫分析:相同的抗體不同的交叉反應(yīng)率

發(fā)布時間:2023-04-13 15:20:07來源:抗體故事

  【摘要】

  免疫分析涉及許多可與抗體結(jié)合但具有不同親和力的結(jié)構(gòu)相似的化合物。免疫分析的一個重要特征是可以檢測化合物的交叉反應(yīng)性,根據(jù)交叉反應(yīng)性的不同可分為高選擇性(對目標化合物特異性強)和低選擇性(對大量類似化合物都產(chǎn)生反應(yīng))。目前的研究表明,交叉反應(yīng)性不是抗體的固有特征,但對于相同抗體采用不同競爭性免疫分析方法,其交叉反應(yīng)性可能有所不同。如方法中使用敏感的標記物、低濃度抗體和修飾(競爭)抗原,則其具有較低的交叉反應(yīng)性,即更具特異性。通過對磺胺類和氟喹諾酮類的酶免疫測定和熒光偏振免疫測定的數(shù)學建模和試驗比較,證實了這一觀點,使用較低濃度的試劑可將交叉反應(yīng)性降低五倍。此外,通過改變各免疫反應(yīng)物濃度的比率以及抗原抗體反應(yīng)的動力學或平衡模式,即使在相同的測定方法中,交叉反應(yīng)性也會發(fā)生變化。本研究證明了在不使用新的抗原抗體的情況下,也可以對免疫分析的特異性進行有效調(diào)節(jié)。

  【背景】

  用免疫技術(shù)評估化學相似物的檢測,交叉反應(yīng)性 (CR) 是最常用的參數(shù)。在競爭性免疫分析方法中,對于最大測量精度,交叉反應(yīng)性通常是指使檢測信號降低50% 的濃度比率:

       IC交叉反應(yīng)性(CR) =(目標分析物)/(被測交叉反應(yīng)物)× 100%

  迄今為止,文獻中已經(jīng)報道了眾多影響免疫分析的選擇性的方法。最常見的一種方法是設(shè)計抗原,選擇抗原最優(yōu)結(jié)構(gòu),以產(chǎn)生針對抗原表位的特異性抗體。當前已開發(fā)出一些預(yù)測免疫原結(jié)構(gòu)的理論工具,如免疫復合物的三維建模和定量構(gòu)效關(guān)系分析 (QSAR),但所建立的模型往往只涉及某類化合物,無法應(yīng)用到其他類別。另一種改變免疫分析選擇性的方法是突變修飾,包括對抗體的抗原結(jié)合位點進行靶向遺傳設(shè)計。然而,這些工作需要耗費大量的時間和資源,目前僅有一小部分成功開發(fā)。作者注意到,多克隆抗體中低親和力和高親和力的組分對免疫復合物檢測的影響隨著分析物含量的變化而不同?;谶@一原因,作者添加少量交叉反應(yīng)分析物來阻斷抗體中不良的高親和力組分。在影響交叉反應(yīng)性的其他因素中,反應(yīng)介質(zhì)的組成值得關(guān)注,pH值或其他測定條件對其選擇性有一定影響。例如,不同濃度的尿素可以改變不同檢測方法的交叉反應(yīng)性。

  本文表明,交叉反應(yīng)性不是僅由免疫試劑的固定參數(shù)確定,還受分析條件的影響。其中,使用不同免疫標記物及其標記方法、不同濃度的免疫試劑、不同的免疫反應(yīng)時間,都會對交叉反應(yīng)性產(chǎn)生一定影響。在本研究中,對上述方法的預(yù)期效果進行了數(shù)學建模,并用兩種免疫分析方法進行了試驗驗證。該數(shù)學模型使用了競爭性免疫分析方法,重點關(guān)注抗原親和力差異,而不考慮非靶標干擾。得到的理論表明了該方法的通用性和應(yīng)用于不同化合物的前景。試驗驗證了理論假設(shè)和結(jié)論的正確性。試驗以磺胺類 (SAs) 和氟喹諾酮類中數(shù)十種結(jié)構(gòu)相似的化合物為代表,采用熒光偏振免疫測定法 (FPIA) 和酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA) 兩種分析方法進行檢測。

  【研究內(nèi)容】

  1.競爭免疫分析模型

  在競爭性免疫分析反應(yīng)體系中,三種化合物相互作用:抗體(Ab)、測試樣品中的未標記抗原(Ag) 以及修飾的競爭抗原(Ag*) ,形成AbAg和AbAg*兩種類型的復合物。標記信號反映AbAg*的含量。ELISA中,Ag*是固定在固相上的抗原,標記信號反映AbAg*復合物的形成。在競爭期間或隨后階段直接引入可檢測標記物,會影響信號強度,但不會影響其濃度依賴性。

  因此,在描述競爭性免疫分析時,應(yīng)考慮以下化學過程:

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  所有試劑濃度的變化率由微分方程組描述:

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  其中kai和kdi分別表示結(jié)合和解離的動力學常數(shù)。

  在平衡模式下進行分析時(濃度變化率為零),微分方程(3)-(5)方程組變?yōu)榇鷶?shù)方程組:

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反應(yīng)物的濃度也與質(zhì)量守恒定律的方程式相關(guān):

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AbAg和AbAg*復合物的平衡解離常數(shù)分別表示為Kd1和Kd2:

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式(8)-(12)的復式完全描述了平衡競爭系統(tǒng),并推導出每個組分平衡濃度的三次方程。以游離抗體濃度為例,三次方程為:

  三角變換提供了該方程的解:

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  利用該解,可以計算出檢測到的復合物[AbAg*]的濃度:

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  式(15)描述了測定方法的校準曲線。將初始濃度和相互作用參數(shù)的不同值代入該方程,可以研究這些因素對校準曲線位置和振幅的影響。使用式(15)可以估計結(jié)構(gòu)相似的分析物在不同競爭免疫分析條件下CR的變化。

  2.反應(yīng)參數(shù)對IC50值的影響

  圖1顯示了兩種標記抗原初始濃度Kd1值變化的理論校準曲線。校準曲線的位置以及相應(yīng)的IC50值都取決于結(jié)合常數(shù)和所用試劑的濃度。

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  圖1 在抗體-未標記抗原復合物解離平衡常數(shù)的不同值下,平衡競爭免疫分析的理論校準依賴性。式(15)的參數(shù)如邊欄所示。(a) 顯示出 [Ag*]0=20nM時常數(shù)Kd1從0.1到10nM的變化;(b) 顯示出 [Ag*]0=2nM時Kd1常數(shù)的相同方差

  通過同時改變幾個測定參數(shù),可以調(diào)整校準曲線的參數(shù),以達到所需的信號強度和IC50值。因此,圖2顯示了標記抗原和抗體的初始濃度對校準曲線形狀和位置的聯(lián)合作用。信號強度由參數(shù)[Ab]0和[Ag*]0中較小者決定。這兩個參數(shù)以三種方式影響IC50:(i) 抗體濃度降低會使IC50值降低;(ii) 抗體過量時,[Ag*]0降低導致信號變化幅度降低,IC50值增加;(iii) 缺乏抗體時,[Ag*]0降低,導致信號變化幅度以及IC50值降低。通過降低[Ab]0和[Ag*]0的濃度,可以實現(xiàn)IC50值的降低,以達到檢測下限。

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  圖2在標記抗原和抗體初始濃度的不同值下,平衡競爭免疫分析的理論校準依賴性。

  3.CR值對分析方法的理論依賴

  用相同濃度的分析試劑測定幾種結(jié)構(gòu)相似的化合物時,交叉反應(yīng)性由這些化合物與抗體相互作用的常數(shù)確定。圖3顯示了三種模型分析物 (I、II和III) 的理論校準曲線,其免疫復合物的平衡解離常數(shù)分別為0.1、1和10nM。計算三種選定濃度的分析反應(yīng)物曲線:測定 (a) [Ab]0=1nM,[Ag*]0=1nM;(b) [Ab]0=10 nM,[Ag*]0=1nM;(c) [Ab]0=10nM,[Ag*]0=10 nM。

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  圖3三種模型 結(jié)構(gòu)相似化合物的平衡競爭免疫分析的理論校準依賴性(I、II和III;各子圖中分別為黑色、紅色和藍色曲線),以及使用濃度不同的三種分析反應(yīng)物測定:(a)[Ab]0=1nM,[Ag*]0=1nm;(b)[Ab]0=10nM,[Ag*]0=1nM;(c)[Ab]0=10nM,[Ag*]0=10nm。

  利用曲線計算的IC50值整合在表1中。交叉反應(yīng)性可以根據(jù)化合物I、II和III IC50值的比率來量化,數(shù)據(jù)證實了IC50值隨分析反應(yīng)物濃度的變化。交叉反應(yīng)性不是抗體本身或競爭物的固有特征,而是受特定測定方法及其條件的影響。因此,不同分析方法中使用相同抗原-抗體對測定結(jié)構(gòu)相似的化合物,會得到不同的交叉反應(yīng)性范圍。

  表1圖3中校準依賴性的IC50值 (nM)

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  獲得的數(shù)據(jù)表明,交叉反應(yīng)性既取決于反應(yīng)物濃度的絕對值,也取決于反應(yīng)物之間的比率。

  在抗體和標記/固定抗原濃度相等的情況下,它們的濃度越高,交叉反應(yīng)性就越高。[Ab]0= [Ag*]0= 1 nM時,Kd= 0.1和10 nM的抗原,IC50值相差近8倍(圖3a,表1),而[Ab]0和[Ag*]0高10倍時,相同抗原的IC50值相差2.7倍(圖3c,表1)。試劑的配比對交叉反應(yīng)的影響更大。在[Ag*]0和[Ab]0濃度分別為1和10 nM時,Kd為0.1和10 nM的抗原,IC50值僅相差1.5倍(圖3b,表1)。因此,CR值的變化約為5倍。使用近似相等濃度的抗體和標記/固定抗原可以使分析最具選擇性。在這種情況下,應(yīng)使用盡可能低濃度的試劑。所用濃度的絕對值由標記物的最小可檢測濃度決定。

  4.模型的試驗驗證

  為了試驗證實所建立的理論,作者對一組結(jié)構(gòu)相似的磺胺類化合物進行了免疫化學測定。用兩種平衡競爭免疫分析法(ELISA和FPIA)檢測了7種化合物。對這兩種免疫分析方法進行了初步條件優(yōu)化,以實現(xiàn)對目標分析物檢測最高的靈敏度和可接受的信號幅度。試劑的比例選擇如下:ELISA板上固定的半抗原蛋白濃度為76 nM,特異性抗體濃度為0.3 nM;FPIA中,SA-(熒光素衍生物)偶聯(lián)物濃度為0.16 nM,特異性抗體濃度為0.2 nM。兩種分析中,免疫反應(yīng)的時間均相FPIA為5分鐘,ELISA為1小時。

  兩種檢測方法中所選擇的抗體濃度近似,而修飾半抗原的濃度在數(shù)量級上有所不同,并且與FPIA相比,ELISA的抗體濃度明顯更高,用于包被的半抗原-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的濃度是FPIA中SA-(熒光素衍生物)偶聯(lián)物濃度的475倍。根據(jù)現(xiàn)有概念,固定在酶標板上超過90%的蛋白質(zhì)可能失去活性,即ELISA中修飾半抗原(所提出的模型中的Ag*)濃度比FPIA高幾倍。這意味著ELISA比FPIA具有更強的交叉反應(yīng)性。

  采用兩種方法測定SAs的結(jié)果整合至表2中,證實了模型的預(yù)測:對于磺胺二甲氧嘧啶,ELISA的交叉反應(yīng)性超過FPIA高達8.5倍。因此,證實了免疫分析的交叉反應(yīng)性不僅取決于所使用抗體的性質(zhì),還取決于分析方法的特定參數(shù)。

  表2在FPIA和ELISA技術(shù)中,磺胺及其相對于磺胺氯吡啶的IC50和CR值

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  交叉反應(yīng)性也可以通過調(diào)節(jié)同一種分析方法中試劑的濃度和比例來改變。如表3所示,使用FPIA方法測定四種磺胺類化合物的過程中,隨著抗體和標記半抗原濃度增加5倍,交叉反應(yīng)性從2倍(對于磺胺嘧啶)增加到9.5倍(對于磺胺二甲氧嘧啶)。

  表3測定FPIA校準曲線的IC50值和磺胺類藥物在不同濃度抗體和標記半抗原下的交叉反應(yīng)性。A— SA-(熒光素衍生物)偶聯(lián)物濃度= 0.16 nM,特異性抗體濃度= 0.2 nM。B— SA-(熒光素衍生物)偶聯(lián)物濃度= 0.8 nM,特異性抗體濃度= 1 nM。

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  對于非平衡條件,交叉反應(yīng)性也取決于免疫反應(yīng)的持續(xù)時間。對于均相分析 (FPIA) ,反應(yīng)可以更快地達到平衡,但試劑在ELISA中的孵育時間 (1 h) 幾乎比FPIA (10 min) 久一個數(shù)量級。在動力學關(guān)聯(lián)常數(shù)為1061/(M * s),試劑濃度為1 nM時,反應(yīng)在1 h內(nèi)可接近平衡態(tài)的95%,可以認為是平衡態(tài),但在較低的關(guān)聯(lián)常數(shù)下,在ELISA反應(yīng)時間 (1 h) 下是非平衡態(tài)。

  為了研究動力學參數(shù)對免疫分析特異性的影響,作者使用數(shù)值方法求解反應(yīng)的動力學方程,并開發(fā)了COPASI軟件。得到的理論校準曲線表明,當接近平衡時,具有不同結(jié)合常數(shù)的分析物在檢測時靈敏度的差異增大。由表4可以看出,在反應(yīng)時間為600 s時,動力學關(guān)聯(lián)常數(shù)為106和107M−1s−1的分析物,其IC50值相差1.5倍,而反應(yīng)時間為3600 s時,相同分析物的IC50值相差6.4倍。因此,對于非平衡反應(yīng),交叉反應(yīng)性也取決于測定時間。為了獲得廣泛的特異性,檢測時競爭反應(yīng)階段的時間應(yīng)該縮短。

  表4不同免疫反應(yīng)時間(t)和不同動力學關(guān)聯(lián)常數(shù)(ka)的非平衡競爭試驗理論校準曲線的IC50值??乖苌颷Ag*]0的濃度為0.16 nM,特異性抗體[Ab]0的濃度為0.2 nM,所有動力學解離常數(shù)kd為0.0001 /s,與修飾抗原的結(jié)合常數(shù)ka2為107M−1s−1。

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  為了驗證上述理論假設(shè),作者采用ELISA方法對三種氟喹諾酮類抗菌藥物(克林沙星、莫西沙星和恩諾沙星)進行檢測。表5總結(jié)了不同免疫反應(yīng)時間下測定的特異性參數(shù)。結(jié)果如預(yù)期,將分析物與抗體孵育1h的試驗在IC50值和交叉反應(yīng)上的差異比孵育7mins的試驗大幾倍??肆稚承呛投髦Z沙星的CR值在孵育7mins時相差4.6倍,在孵育1 h時相差50倍(比值增加了11倍)。

  表5氟喹諾酮類藥物在不同免疫競爭反應(yīng)時間下測定的試驗校準曲線的交叉反應(yīng)性和IC50值

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  5.本研究結(jié)果在生物傳感器上的應(yīng)用前景

  本研究得到的結(jié)果表明,基于免疫或其他生物受體識別的分析,其交叉反應(yīng)性可以在不需要新的免疫試劑/生物受體的情況下改變。改變反應(yīng)性的有效方法包括:(1)將標記物更換為在較高或較低濃度時檢測的標記物;(2)改變待測分析物受體分子與修飾競爭物的濃度比(上述模型中[Ab]0和[Ag*]0)。這兩種方法都可以在競爭性生物傳感器系統(tǒng)中實現(xiàn)。酶、納米顆粒和其他結(jié)構(gòu)常用作生物傳感器中的標記物。標記物產(chǎn)生的光學、電化學、測溫、壓電或磁信號反映了與修飾分析物的受體分子和測試樣品中的分析物結(jié)合后的競爭結(jié)果。

  一般來說,可以對方法進行以下優(yōu)化:

  如果需要免疫傳感器具有窄譜選擇性,即降低目標分析物的結(jié)構(gòu)類似物的CR,則需要降低抗體和修飾的競爭抗原的濃度,并將它們的摩爾比改為1:1,且選擇靈敏度更高的標記物,如具有較高比活性的酶,更強吸收的熒光標記物,或更有效的電信號放大器。

  如果需要免疫傳感器具有廣譜選擇性,即增加所用抗體識別的結(jié)構(gòu)相似化合物的CR,則需要采取相反的策略——增加抗體和修飾的競爭抗原的濃度,并采用非等摩爾比例。在這種條件下,免疫傳感器分析可以通過使用相同的信號測定方法或減少信號產(chǎn)生的持續(xù)時間來實現(xiàn)。增加CR可能會使免疫傳感器的靈敏度降低。

  【結(jié)論】

  迄今為止,文獻中已經(jīng)報道了許多調(diào)節(jié)免疫分析交叉反應(yīng)性的方法。本研究建立了調(diào)節(jié)免疫分析交叉反應(yīng)率的方法,不需要額外試劑、樣品修飾和其他復雜的操作。待測樣品中如果存在不同親和力、結(jié)構(gòu)相似的化合物,基于免疫分析信號積分(形成的免疫復合物的總量)得出的有毒污染物超過允許濃度的結(jié)論與假陽性和假陰性結(jié)果的顯著風險相關(guān),這取決于檢測到的不同化合物的比例。從一種分析方法轉(zhuǎn)換為另一種分析方法,可以最大限度地減少低親和力現(xiàn)象(降低交叉反應(yīng)性),或者使檢測到的總信號更接近分析物濃度的真實總和(增加交叉反應(yīng)性)。同時,考慮到近年來對多種免疫分析替代標記物的研究,可以通過替換標記物來解決使用其他濃度試劑的問題。另一種基于免疫反應(yīng)物濃度變化和/或從動力學或平衡模式轉(zhuǎn)移的方法可以在不改變所用反應(yīng)物的情況下實現(xiàn)。本文提出的方法可應(yīng)用于不同的分析物,在不改變抗體的抗原結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)而對特異性產(chǎn)生影響的情況下,所提出的方法可以滿足醫(yī)學和獸醫(yī)診斷、食品和飼料控制、公共安全保障以及自然資源監(jiān)測等應(yīng)用的需求。

原文來源:

Sotnikov D V, Zherdev A V, Zvereva E A, et al. Changing cross-reactivity for different immunoassays using the same antibodies: Theoretical description and experimental confirmation[J]. Applied Sciences, 2021, 11(14): 6581.

原文鏈接:

https://doi.org/10.3390/app11146581

指導教師:

王戰(zhàn)輝


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